Transponējamo elementu variāciju izpēte parastās priedes (Pinus sylvestris L.) gēnu rajonos

Eiropas Reģionālās attīstības fonda programmas "Izaugsme un nodarbinātība" specifikā atbalsta mērķa 1.1.1. "Palielināt Latvijas zinātnisko institūciju pētniecisko un inovatīvo kapacitāti un spēju piesaistīt ārējo finansējumu, ieguldot cilvēkresursos un infrastruktūrā" pasākums 1.1.1.2. "Pēcdoktorantūras pētniecības atbalsts" vienošanās Nr. 1.1.1.2/VIAA/1/16/094

Pēcdoktorants Angelika Voronova
Atbildīgā persona Dainis Ruņģis

Gēnu strukturālo variāciju noskaidrošana un raksturošana genomā ir svarīgs posms selekcijas materiāla uzlabošanai nākotnē. Genoma sekvence dažām kailsēkļu sugām ir noskaidrota tikai nesen, iegūto datu kvalitāte un gēnu anotācija joprojām tiek uzlabota. Noskaidrots, ka sekvenēto skujkoku genomi satur ievērojamu skaitu transponējamo elementu gēnu intronos, kas savukārt spēj ietekmēt gēnu darbību, piemēram, inducējot vai bloķējot tā ekspresiju, mainot gēna splaisingu vai arī hromatīna veidošanās procesus. Transponējamie elementi tiek klasificēti divās klasēs: retrotranspozonos, kas ir īpaši izplatīti augu genomos un pēc savas struktūras un izplatīšanas mehānisma līdzinās retrovīrusiem; un DNS transpozoniem, kas ir mazāk izplatīti, tomēr to sekvence var būt īsāka un tie ir bieži cēloņi gēnu mutaģenēzē dažādu augu genomos.

Pētījuma mērķis ir identificēt parastās priedes (Pinus sylvestri  L.) gēnus, saistītus ar transponējamo elementu izraisītajām strukturālajām izmaiņām. Raksturot identificēto gēnu saistību, kā arī atbildes veidošanu dažādu stresa faktoru ietekmē. Izveidot DNS molekulāros marķierus atrasto strukturālo variāciju izpētei starp priedes selekcijas programmā iesaistītām ģimenēm, kas iepriekš uzrādījušas ģenētiski nosacītas saimnieciski nozīmīgu īpašību atšķirības, kā arī gēnu ekspresijas līmeņa noteikšanai dažādos priedes audos vai vides apstākļos.

Pētījuma rezultātā tiks iegūtas jaunas zināšanas par priedes saimnieciski nozīmīgo gēnu darbību un to ietekmējošiem ģenētiskiem faktoriem; nekodējošo gēnu rajonu variāciju priedes populācijā. Pētījuma realizācijas procesā tiks paaugstināta jaunā zinātnieka pētnieciskā darba kompetences un iemaņas.

Plānotās darbības ir:

1. Priedes specifisko mobilo elementu sekvenču apkopojums.
2. Mobilitātes un tīklošanās aktivitātes ietvaros tiks veikta priedes genomiskas sekvences bioinformātiskā analīze.
3. Molekulāro marķieru izveide, izmantojot identificētas struktūrīpašības.
4. Paraugu ievākšana, DNS un RNS izdalīšana.
5. Variācijas izpēte parastās priedes selekcijas ģimeņu DNS paraugos.
6. Iespējami nozīmīgo gēnu darbību ietekmējošo strukturālo variāciju ekspresijas analīze.

Aktualitātes

1. 1.09.2017. uzsākts pētījums.
2. 13.–16.09.2017.09. Dalība starptautiskajā simpozijā "Nekodējošais genoms" (The Non-Coding Genome) ar postera prezentāciju par nekodējošo ribonukleīnskābju (RNS) pētījumiem Investigation of transposable element derived polymorphisms in the Scots pine (Pinus sylvestris L.) genome 
3. 3.10.2017. Prezentācija Ģenētisko resursu centra radošās grupas seminārā par simpoziju "Nekodējošais genoms" (komandējuma atskaite).
4. 4.10.2017. Uzsākta priedes specifisko mobilo elementu sekvenču apkopošana.
5. 19.11.–10.12.2017. Zviedrijas Lauksaimniecības zinātņu universitātē apgūtas genoma sekvenču bioformātiskās analīzes metodes, izmantojot UPPMAX sistēmu (Uppsala Multidisciplinary Center for Advanced Computational Science), to izmantojot priežu genoma bioinformātiskā analīzē, kas ir viens no šī pētījuma paredzētajiem uzdevumiem (komandējuma atskaite).
6. 3.01.2018. Prezentācija Ģenētisko resursu centra radošās grupas seminārā, kurā tika prezentētas apgūtās genoma sekvenču bioinformātiskās analīzes metodes, izmantojot UPPMAX sistēmu, to izmantojot priežu genoma bioinformātiskā analīzē. Metode tika apgūta Augu bioloģijas labotatorijā Zviedrijas Lauksaimniecības zinātņu universitātē.
7. 2.02.2018. Dalība Latvijas Universitātes 76. konferences Molekulārās bioloģijas sekcijā (programma).
   A. Voronova prezentēja referātu Mobilo ģenētisko elementu izplatība priežu gēnu rajonos, kura autori ir Angelika Voronova, Martha Rendon (Zviedrijas Lauksaimniecības Zinātņu universitāte), Par Ingvarsson (Zviedrijas Lauksaimniecības Zinātņu universitāte) un Dainis Ruņģis.
8. 3.2018. Pirmais pētījuma pusgada pārskats
9. LU 76. konferences tēzes tiks publicētas žurnālā Environmental and Experimental Biology
10. 26.03.2018. "Zinātnes Vēstnesī" publicēts populārzinātnisks raksts Transponējamo elementu variāciju izpēte parastās priedes (Pinus sylvestris L.) gēnu rajonos 
11. 4.–8.07.2018. Dalība starptautiskā konferencē "Evolution. Genetic Novelty/Genomic Variations by RNA Networks and Viruses" Zalcburgā, Austrijā ar A. Voronovas stenda referāta prezentāciju: Voronova A., Rendon M., Ingvarsson P., Ruņģis D. Distribution of predicted Retrotransposon LTRs in gene flanking regions of the Pinus taeda genome v.2.0. 
12. 24.–26.08.2018. Dalība Latvijas un Lietuvas Jauno zinātnieku apvienību rīkotajā pasākumā "International smithy ideas 2018", kurā A. Voronova prezentēja referātu "Non-coding genome dynamics in stress conditions".
13. 9.2018. Otrais pētījuma pusgada pārskats 
14. 28.09.2018. Dalība divos "Eiropas Zinātnieku nakts 2018" pasākumos: LVMI "Silava" "Eiropas Zinātnieku nakts" pasākumā A. Voronova nolasīja populārzinātnisko referātu-lekciju (40 min.) "Priedes gēni un tos regulējošie lēkājošie elementi"; Rīgas Centrālajā dzelzceļa stacijā organizētajā pasākumā (programma) A. Voronova prezentēja referātu (10 min.) Priedes genoma noslēpumi: gēnu tīklošanās ar lēkājošo elementu starpniecību 
15. 24.–26.10.2018. Dalība VII Baltijas Ģenētikas kongresā Rīgā, kurā A. Voronova prezentēja referātu: Voronova A., Rendon M., Ingvarsson P., Ruņģis D. Evaluation of gene networks formed by presence of similar transposable elements in gene flanking regions and introns. Konferences referātu tēzes publicētas žurnālā Enviromental and Experimental Biology, 16(3), p. 275.
16. 12.2018. LVMI "Silava"avīzes "Silavas Zīle" 2018. gada decembra numurā publicēts raksts Gēnus regulējošo sekvenču izpēte priedes genomā 
17. 14.01.2019. Pabeigta priežu referenču genomu analīze. Tika atrasti transponējamie elementi, kas potenciāli saista gēnus vienotās atbildes tīklos. Divas gēnu kopas tiks pārbaudītas parastās priedes genomam, vai tas satur līdzīgus atkārtojumus. Izveidoti molekulārie marķieri un divas DNS kolekcijas: 150 paraugi no dabīgas audzes un 96 pluskoku paraugi ar dažādu izcelsmi Latvijā.
18. 3.2019. Trešais pētījuma pusgada pārskats 
19. 18.03.2019. Sagatavots un recenzēšanai žurnālā BMC Research Notes iesniegts raksts.
20. 29.04.2019. Publicēts zinātnisks raksts: Voronova A. 2019. Retrotransposon expression in response to in vitro inoculation with two fungal pathogens of Scots pine (Pinus sylvestris L.). BMC Research Notes, 12, 243; https://doi.org/10.1186/s13104-019-4275-3 
21. 13.–14.05.2019. A. Voronova piedalās zinātniskajās debatēs Crossroads between transposons and gene regulation (Transpozonu un gēnu regulācijas krustpunkti) Londonā, AK, tika prezentēti un apspriesti pētījuma rezultāti.
22. 9.05.2019. Dalība Eiropas dienas akcijā "Atpakaļ uz skolu 2019": A. Voronova iepazīstināja 10.–12. klašu skolēnus ar pētnieka ikdienu, profesijas īpatnības un savu pētījumu.
23. 9.2019. Ceturtais pētījuma pusgada pārskats 
24. 3.06.–30.09.2019. Veiktas analīzes ar priežu populāciju paraugiem, izmantojot transponējamo elementu molekulāros marķierus. Analīzēm tika izmantota kapilārās gēlelektroforezes ierīce Labchip GX, ar kuras palīdzību ir iespējams genotipēt lielas paraugu kopas. Atrasti fragmenti, kuru frekvence ir izmainīta populācijās ar augstāku vai zemāku izturību pret skujbiri (Lophodermium seditiosum) vai abiotisko faktoru ietekmē. Interesējošie fragmenti klonēti un sekvenēti.
25. 1.10.–18.12.2019. Veikta L. seditiosum inokulēto priežu stādu paraugu ievākšana un nukleīnskābju izdalīšana. Balstoties uz iegūtajiem rezultātiem un jaunām iespējām izmantot mūsu laboratorijā Ion Torrent sekvenātoru, tika pārplānoti ar ekspresiju saistītie eksperimenti. Tika izstrādāts inovatīvs protokols, kas varētu palīdzēt noskaidrot parastās priedes gēnus, saistītus ar references genomos gēnu rajonos izplatītiem transponējamiem elementiem. Tika izveidotas molekulārās zondes gēnu tīklu noskaidrošanai.
26. 31.01.2020. Ģenētisko resursu centrā notiek A. Voronovas organizēts seminārs "Mendeley rīku (Desktop, Web Importer, Word plugin) praktiskais lietojums zinātnisko publikāciju sagatavošanā".
27. 2.01.–7.02.2020. Veikta sagatavotu cDNS paraugu amplifikācija ar zondēm, analīze, attīrīšana un saplūdināšana ar mērķi iegūt nepieciešamās kvalitātes un kvantitātes paraugus priekš plānotās sekvenēšanas.
28. 11.–13.02.2020. No sagatavotiem paraugiem veiksmīgi izveidotas 19 sekvenču bibliotēkas un veikta NGS sekvenēšana, izmantojot IonChef un IonTorrent Ion GeneStudio S5 aparatūru. Jaunās aparatūras darbības uzsākšanai līdzi sekoja produktu speciāliste Rita Bandariavičiūtė no Lietuvas, kura apmācīja visus ieinteresētos kolēģus par praktisko aparatūras un reaģentu komplektu lietojumu un niansēm. Iegūts 100% daļiņu piesātinājums ar sekvencēm un 89% čipa pārklājums ar daļiņām, sekvenēšana rezultējās ar vairāk kā 10,5 miljonu nolasījumiem. Iegūtie rezultāti palīdzēs noskaidrot regulatīvo mobilo elementu izplatību parastās priedes (P. sylvestris) gēnos un novērtēt iepriekš izstrādātos protokolus.
29. 12.03.2020. Piektais pētījuma pusgada pārskats
30. 12.–15.05.2020. Dalība virtuālajā konferencē Regulatory & Non-Coding RNAs, kuru orgnizē Cold Spring Harbor Laboratory, ASV (programma).  A. Voronova prezentē posteri par pētījuma rezultātiem: Voronova A., Rendón-Anaya M., Ingvarsson P., Kalendar R., Ruņģis D. Transposable elements interconnect genes into networks via non-coding RNAs and other regulatory factors in pine, publicēts pētījuma kopsavilkums. 
31. 28.–29.05.2020. A. Voronovas tiešsaistes dalība Daugavpils Universitātes 62. starptautiskajā zinātniskā konferencē ar referātu Variation of mobile genetic elements in pine genes and flanking regions
32. 1.06.2020.–24.08.2020. Izstrādāts un apkopots protokols "TE-asociētu gēnu polimorfismu genotipēšana mazizpētītam sugām" (Protocol: Gene TE-associated polymorphism genotyping for non-model species), kas sniedz iespēju atklāt sugai specifiskus transponējamo elementu insertus gēnu tuvumā. Biotinilēti oligonukleotīdi ļauj atlasīt transkriptus, kas satur homoloģiju ar transponējamo elementu sekvencēm, šie transkripti tiek pavairoti, attīrīti un sekvenēti ar NGS tehnoloģiju. Izmantojot iegūtos datus tika izveidoti molekulārie marķieri polimorfismu verificēšanai.
33. 17.–26.08.2020. Sagatavots populārzinātnisks raksts par pētījuma tēmu un rezultātiem Kas ir transponējamie elementi un kādēļ tos pēta visa pasaulē? 
34. 16.10.2020. Publicēts zinātnisks raksts: Voronova A., Rendón-Anaya M., Ingvarsson P., Kalendar R., Ruņģis D. 2020. Comparative Study of Pine Reference Genomes Reveals Transposable Element Interconnected Gene Networks. Genes, 11, 1216; https://doi.org/10.3390/genes11101216